新版GB/T 16294-2025《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))沉降菌的測試方法》對沉降菌培養(yǎng)皿暴露時(shí)間提出了新要求，明確需確認(rèn)單個(gè)培養(yǎng)皿的最佳暴露時(shí)間，且暴露時(shí)間一般不超過4小時(shí)，同時(shí)補(bǔ)充了培養(yǎng)基促生長能力的驗(yàn)證要求；相較于舊版，新版不再允許簡單將短時(shí)間暴露結(jié)果換算為4小時(shí)結(jié)果，需通過試驗(yàn)確定適宜的暴露時(shí)長，以避免因培養(yǎng)基脫水、菌落生長競爭等因素導(dǎo)致檢測結(jié)果失真，確保沉降菌監(jiān)測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和代表性。以下為具體方案：

1.確認(rèn)目的

確認(rèn)沉降菌監(jiān)測用培養(yǎng)基在0.5小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)暴露時(shí)間下，外觀無異常且仍具備良好的促生長能力，且在經(jīng)過5天的培養(yǎng)后，培養(yǎng)基仍然符合《中華人民共和國藥典2025年版四部通則1105》及GB/T 16294-2025《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))沉降菌的測試方法》要求，為沉降菌監(jiān)測提供可靠的培養(yǎng)基暴露時(shí)間依據(jù)。

2.確認(rèn)依據(jù)

2.1《中華人民共和國藥典2025年版四部通則1105 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法》
2.2 GB/T 16294-2025《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))沉降菌的測試方法》

3.適用范圍

本方案適用于沉降菌監(jiān)測用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）在規(guī)定暴露時(shí)間下的性能確認(rèn)，涵蓋外觀質(zhì)量及培養(yǎng)基適用性驗(yàn)證。

4.試驗(yàn)材料與設(shè)備

4.1培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA），每皿傾注量為15ml（藥典要求15-20ml，本次確認(rèn)采用最不利條件，選擇15ml進(jìn)行確認(rèn)），符合《中華人民共和國藥典2025年版四部》要求。

4.2試驗(yàn)菌種：

采用《中華人民共和國藥典2025年版四部通則1105》規(guī)定的5種標(biāo)準(zhǔn)菌株，傳代次數(shù)不超過5代：
1）金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC(B)26003
2）銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC(B)10104
3）枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC(B)63501
4）白色念珠菌（Candida albicans）CMCC(F)98001
5）黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC(F)98003

4.3主要設(shè)備：

1）潔凈培養(yǎng)箱（30~35℃、20~25℃）
2）壓力蒸汽滅菌器
3）生物安全柜、超凈工作臺
4）菌落計(jì)數(shù)器
5）無菌培養(yǎng)皿（直徑90mm）
6）溫濕度計(jì)、壓差計(jì)（用于環(huán)境參數(shù)監(jiān)測）

5.確認(rèn)條件

5.1測試環(huán)境：選擇公司換氣次數(shù)最大的潔凈房間，測試前凈化空調(diào)系統(tǒng)正常運(yùn)行不少于30分鐘，維持靜態(tài)環(huán)境（無生產(chǎn)操作），實(shí)時(shí)監(jiān)測并記錄溫濕度、壓差、換氣次數(shù)等環(huán)境參數(shù)。

5.2采樣點(diǎn)設(shè)置：基于房間布局及風(fēng)險(xiǎn)評估，確定3個(gè)代表性采樣點(diǎn)（如房間對角線三點(diǎn)、氣流關(guān)鍵區(qū)域等），每個(gè)采樣點(diǎn)放置18個(gè)無菌培養(yǎng)皿（每皿培養(yǎng)基15ml）。

6.確認(rèn)步驟

6.1培養(yǎng)基制備：按培養(yǎng)基說明書配制TSA培養(yǎng)基，121℃壓力蒸汽滅菌15分鐘，滅菌后在超凈工作臺內(nèi)傾注無菌培養(yǎng)皿，每皿控制15ml，待培養(yǎng)基自然凝固（表面平整無氣泡）后備用。同時(shí)制備同批次未暴露的培養(yǎng)基，作為菌液對照組。

6.2暴露操作：

1）按設(shè)定的3個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)均勻擺放18個(gè)凝固后的培養(yǎng)基，打開皿蓋使培養(yǎng)基表面完-全暴露于空氣中，記錄暴露開始時(shí)間。

2）嚴(yán)格控制暴露時(shí)間，分別在0.5小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，從每個(gè)采樣點(diǎn)取出6個(gè)培養(yǎng)皿，具體分組標(biāo)記：
1個(gè)標(biāo)記為“供試品組"，作為暴露環(huán)境的空白對照；
5個(gè)分別標(biāo)記為“試驗(yàn)組-金黃色葡萄球菌"“試驗(yàn)組-銅綠假單胞菌"“試驗(yàn)組-枯草芽孢桿菌"“試驗(yàn)組-白色念珠菌"“試驗(yàn)組-黑曲霉"，分別對應(yīng)5種試驗(yàn)菌種；
剩余培養(yǎng)皿繼續(xù)按設(shè)定時(shí)間暴露，直至所有時(shí)間節(jié)點(diǎn)完成取樣。

6.3外觀檢查：暴露取樣后，立即對各時(shí)間梯度的供試品組、試驗(yàn)組培養(yǎng)基進(jìn)行外觀觀察，重點(diǎn)檢查是否存在干裂、收縮、表面不平整、水珠凝聚過多等異常現(xiàn)象，詳細(xì)記錄每個(gè)平板的觀察結(jié)果。

6.4培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)：

1）菌液制備：將5種標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種至適宜液體培養(yǎng)基（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌接種胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，30~35℃培養(yǎng)18~24小時(shí)；白色念珠菌接種沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，20~25℃培養(yǎng)24~48小時(shí)；黑曲霉接種沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，20~25℃培養(yǎng)5~7天），培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，用無菌生理鹽水梯度稀釋至約100cfu/ml，備用。

2）接種操作：
供試品組：取各時(shí)間梯度的供試品組培養(yǎng)基，不接種菌液，作為供試品對照；
試驗(yàn)組：取各時(shí)間梯度對應(yīng)菌種的試驗(yàn)組培養(yǎng)基，分別接種對應(yīng)菌液0.1ml，用無菌涂布棒均勻涂布；
菌液對照組：取未暴露的培養(yǎng)基，分別接種5種菌液各0.1ml，作為菌液濃度對照。
陰性對照組：取未暴露的培養(yǎng)基，不接種菌液作為陰性對照。

3）培養(yǎng)：

試驗(yàn)組：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌接種后的培養(yǎng)基，置于30~35℃培養(yǎng)5天；
試驗(yàn)組：白色念珠菌、黑曲霉接種后的培養(yǎng)基，置于20~25℃培養(yǎng)5天。

菌液組：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌接種后的培養(yǎng)基，置于30~35℃培養(yǎng)3天；
菌液組：白色念珠菌、黑曲霉接種后的培養(yǎng)基，置于20~25℃培養(yǎng)5天。

供試品組：置于30~35℃培養(yǎng)5天。
陰性對照：置于30~35℃培養(yǎng)5天。

4）菌落計(jì)數(shù)：
金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌接種后的培養(yǎng)基培養(yǎng)3天后，用菌落計(jì)數(shù)器分別計(jì)數(shù)各供試品組、試驗(yàn)組、菌液對照組的菌落數(shù)，陰性對照組應(yīng)無菌生長。
白色念珠菌、黑曲霉接種后的培養(yǎng)基培養(yǎng)5天后，用菌落計(jì)數(shù)器分別計(jì)數(shù)各供試品組、試驗(yàn)組、菌液對照組的菌落數(shù)，陰性對照組應(yīng)無菌生長。

7.數(shù)據(jù)計(jì)算與可接受標(biāo)準(zhǔn)

7.1數(shù)據(jù)計(jì)算

每種試驗(yàn)菌的回收率計(jì)算公式：
回收率 =（同時(shí)間點(diǎn)同采樣點(diǎn)試驗(yàn)組菌落數(shù) - 同時(shí)間點(diǎn)同采樣點(diǎn)供試品組菌落數(shù)）÷ 同菌種菌液對照組菌落數(shù)
注：每組菌落數(shù)取3個(gè)采樣點(diǎn)對應(yīng)平板的平均值。

7.2可接受標(biāo)準(zhǔn)

外觀要求：培養(yǎng)完畢后所有暴露時(shí)間梯度的供試品組、試驗(yàn)組培養(yǎng)基均應(yīng)外觀均勻、表面平整，無干裂、無收縮、無水珠凝聚導(dǎo)致的菌落蔓延現(xiàn)象。

微生物指標(biāo)：
陰性對照組：平板應(yīng)無菌生長，否則試驗(yàn)無效；
菌液對照組：每種試驗(yàn)菌的平均菌落數(shù)應(yīng)在80~100cfu范圍內(nèi)（確保菌液濃度準(zhǔn)確）；
試驗(yàn)組：每種試驗(yàn)菌的回收效率應(yīng)在0.5~2.0范圍內(nèi)。

8.結(jié)果記錄與報(bào)告

建立詳細(xì)記錄表格，記錄內(nèi)容包括：培養(yǎng)基制備信息、環(huán)境參數(shù)（溫濕度、壓差、換氣次數(shù)）、采樣點(diǎn)位置、暴露時(shí)間、外觀檢查結(jié)果、各組菌落計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)、回收效率計(jì)算結(jié)果。

匯總所有數(shù)據(jù)，按可接受標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行逐項(xiàng)判定，出具確認(rèn)報(bào)告，明確各暴露時(shí)間下培養(yǎng)基是否符合要求。

9.確認(rèn)結(jié)論

根據(jù)外觀檢查及培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)結(jié)果，綜合判定0.5小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)暴露時(shí)間下，沉降菌用培養(yǎng)基是否滿足監(jiān)測要求，確定適宜的培養(yǎng)基暴露時(shí)間范圍。如2小時(shí)的滿足要求，4小時(shí)的不滿足要求，則定最佳培養(yǎng)基暴露時(shí)間為2小時(shí)。（時(shí)間達(dá)到后需要更換新的培養(yǎng)基）。

10.偏差處理

若確認(rèn)過程中出現(xiàn)外觀異常、陰性對照組有菌生長或回收效率超出規(guī)定范圍，應(yīng)立即終止試驗(yàn)，調(diào)查偏差原因（如培養(yǎng)基制備過程、暴露環(huán)境控制、操作污染等），采取糾正措施后重新開展確認(rèn)。

11.再確認(rèn)周期

當(dāng)培養(yǎng)基配方變更、生產(chǎn)工藝調(diào)整、測試環(huán)境發(fā)生重大變化時(shí)，需重新進(jìn)行本確認(rèn)；正常情況下，每3年進(jìn)行一次再確認(rèn)。